Physics of the living cell

Fisica della cellula vivente

Principi di base, questioni aperte e metodi avanzati

Introduzione alla biofisica cellulare

• Da Schrödinger alla biofisica cellulare contemporanea: domande fondamentali, approcci fisici e applicazioni.
• Scale spaziali e temporali dei processi cellulari.
• Il ruolo delle misure quantitative e dei modelli fisici nello studio dei sistemi viventi.

Microscopia a fluorescenza per l’esplorazione dei sistemi biologici

Fondamenti della fluorescenza

• Principi di base della fluorescenza.
• Proprietà fotofisiche dei fluorofori.
• Spettri di eccitazione ed emissione, resa quantica, photobleaching e fototossicità.

Sonde fluorescenti e strategie di marcatura

• Fluorofori cellulari endogeni e microscopia label-free: principi e applicazioni.
• Fluorescenza geneticamente codificata: la proteina fluorescente verde e le sue varianti.
• Nuove frontiere: fluorofori organici per l’imaging di cellule vive.

Metodi basati sulla fluorescenza per lo studio delle interazioni molecolari

• Trasferimento di energia per risonanza di Förster, FRET.
• Anisotropia di fluorescenza.
• Tempo di vita della fluorescenza e sua sensibilità all’ambiente locale su scala nanometrica.
• Metodi di misura e analisi del tempo di vita della fluorescenza.

Metodi basati sulla fluorescenza per lo studio della dinamica molecolare

Metodi basati su perturbazioni

• Recupero della fluorescenza dopo photobleaching, FRAP.
• Interpretazione della mobilità molecolare, della diffusione e dei processi di legame.

Metodi basati sulle fluttuazioni

• Principi della spettroscopia di correlazione di fluorescenza, FCS.
• Dalla FCS a singolo punto ai metodi di correlazione spaziale e spaziotemporale.
• Scanning FCS, raster image correlation spectroscopy e metodi di pair correlation.

Metodi basati sulla localizzazione e sul tracciamento

• Localizzazione e tracciamento di singole molecole.
• Analisi quantitativa delle traiettorie molecolari.
• Tracciamento orbitale e metodi di imaging basati sul feedback.

Metodi basati sulla fluorescenza per l’imaging a super-risoluzione

• Il limite di diffrazione e i principi della microscopia a super-risoluzione.
• Microscopia ad espansione.
• Microscopia di localizzazione di singole molecole.
• Fluorofori fotoattivabili e fotocommutabili.
• Microscopia PALM e STORM.
• Microscopia a deplezione dell’emissione stimolata, STED.

Casi di studio biologici

Caso di studio 1 — Eterogeneità della membrana cellulare

L’eterogeneità di membrana esiste? Come può essere misurata e quale significato funzionale riveste?

Caso di studio 2 — Organizzazione del citoplasma procariotico ed eucariotico

Crowding molecolare, separazione di fase e organelli privi di membrana.

Caso di studio 3 — Il complesso del poro nucleare

Qual è la sua struttura e come regola il trasporto selettivo tra nucleo e citoplasma?

Caso di studio 4 — Misure dinamiche in sistemi dinamici

Come è possibile misurare la dinamica molecolare all’interno di organelli subcellulari in movimento e in continua riorganizzazione?